GENETICA INVERSA

La genética inversa es una disciplina genética que, partiendo del conocimiento de un fragmento de ADN clonado o secuenciado, investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación, generalmente a nivel masivo. Dicha mutación puede ser puntual, por sustitución de nucleótidos, o más drástica, por ejemplo mediante silenciamiento de genes completos. En cambio, la genética tradicional trata de averiguar la secuencia genética que produce una función conocida. Para tratar de averiguar que fenotipo produce dicha secuencia conocida, se produce un cambio en dicho DNA, y se observa que efectos ha tenido en el organismo.

Generalmente, para efectuar dicho estudio se emplean enfoques globales, genómicos, y por ello sus técnicas, como son el empleo de micromatrices de ADN. Un ejemplo de enfoque de genética inversa es el tilling, en el cual se induce mediante etilmetanosulfonato una mutagénesis en lotes de individuos completos, tras la cual se efectúa un análisis mediante PCR de los mutantes obtenidos. Hoy en día el término genética inversa se utiliza para expresar el descubrimiento de la causa de una enfermedad hereditaria, empezando por el gen responsable hasta llegar a la enzima defectuosa. Gracias a las investigaciones en este campo se ha descubierto la causa de enfermedades como la fibrosis quística o la distrofia muscular de Duchenne, aunque también se han producido nuevos y mejores medicamentos de una forma más rápida.

TECNICAS USADAS

MUTAGENESIS ALEATORIA

Primero se clona el gen cifrando el receptor, y a continuación se introducen mutaciones al azar dentro de la secuencia genética, creando una biblioteca que contiene cientos de variantes del gen. Cada variante del gen tiene mutaciones diferentes por lo que cada una alterará la secuencia aminoacídica para la que codifica, cambiando por tanto la proteína. A continuación, a partir de esa biblioteca, se pueden conseguir cepas donde el receptor se exprese y que tenga las propiedades que queremos analizar. Podemos seleccionar esas variantes en función a su sensibilidad a la temperatura, o los ligandos que las activan, por ejemplo, mediante alguna de las técnicas de “screening” masivo.
Hay varios métodos para conseguir dichas bibliotecas. Se utilizan los mismos agentes mutágenos que en la genética clásica, como son agentes químicos, radiación,… A continuación se describen algunos ejemplos.

CEPAS MUTANTES

La secuencia salvaje se clona en un plásmido y se transforma en una cepa mutante. Como resultado, cada copia del plásmido replicado tiene muchas posibilidades de ser diferente del fenotipo salvaje. Una ventaja de este sistema es que una gran variedad de mutaciones pueden ser incluidas, incluyendo sustituciones y deleciones. La desventaja es que si la cepa sigue acumulando mutaciones en su propio genoma, se necesitan muchos pasos en cuanto a crecimiento de la cepa, aislamiento de plásmidos y transformación de los mismos para obtener una biblioteca útil.

MUTAGENESIS DIRIGIDA

Se crea una mutación en un sitio en concreto del DNA. Puede cambiar regiones reguladoras en el promotor de un gen o hacer que cambie la secuencia aminoacídica para la que codifica variando con ello la función de la proteína. Se puede usar también para crear alelos nulos para que el gen deje de ser funcional. El proceso básico comienza sintetizando un primer de DNA corto, que contenga el cambio de base de interés. A continuación se hibrida con una monocadena de DNA que contenga el gen a analizar. Después, la cadena resultante se extiende con una DNA polimerasa, que copia el resto del gen. Una vez obtenida la molécula dúplex, se introduce en la célula hospedadora y se clona. Por último, seleccionamos los mutantes. Existen diversos mecanismos para llevarla a cabo, siendo quizás el más desarrollado aquel en el que interviene la PCR.
En la mutagénesis dirigida por PCR, se seleccionan dos primers diferentes para que se unan a partes específicas del DNA, uniéndose ambos a los extremos 5’, cada uno en uno, uniéndose entonces los dos primers que habíamos seleccionado a sus lugares correspondientes. Uno de los primers corresponde al fenotipo normal y el otro al fenotipo mutante. A continuación la polimerasa realiza su función completando las moléculas dúplex, es decir, a partir de una dúplex se han obtenido dos monocadenas y a partir de ellas dos dúplex. Se vuelven a desnaturalizar dichas moléculas, por lo que ahora tendremos cuatro monocadenas, dos de ellas normales y dos de ellas con los fragmentos de nuestros dos primers (uno de ellos mutante). Se vuelve a producir la hebra que falta, pero ahora obtenemos una molécula duplex en la cual la polimerasa ha codificado la secuencia complementaria de nuestro primer mutante. Con esto, ya tenemos una molécula dúplex de DNA en la cual ambas hebras han cambiado unos pocos pares de bases con respecto a la salvaje. Este ciclo se sigue repitiendo un número determinado de veces, normalmente sobre las 40, y en ese momento la mutagénesis es detenida. Ya tenemos un número suficiente de cadenas de DNA mutadas como para considerar insignificantes a las cadenas no mutadas. Por último, la sección mutada del DNA se introduce en el organismo que hallamos elegido, normalmente una bacteria.

TIPOS DE CLONACION

Son las diferentes formas de clonación que son:
Partición(fisión) de embriones tempranos: analogía con la gemelaciónnatural. Los individuos son muy semejantes entre sí, pero diferentes a sus padres. Es preferible emplear la expresión gemelaciónartificial, y no debe considerarse como clonación en sentido estricto.
Paraclonación:transferencia de núcleos procedentes de blastómeros embrionarios o de células fetales en cultivo a óvulos no fecundados enucleados y a veces, a zigotos enucleados. El “progenitor” de los clones es el embrión o feto.
Clonación verdadera:transferencia de núcleos de células de individuos ya nacidos a óvulos o zigotos enucleados. Se originan individuos casi idénticos entre sí y muy parecidos al donante.